کارگاه عملی – نظری کلونینگ , نشاندار کردن و هیبریدیزاسیون اسید ه

کارگاه عملی – نظری کلونینگ , نشاندار کردن و هیبریدیزاسیون اسید های نوکلئیک(قسمت دوم)

انجام واکنش Ligation:

1- مقدار insert و vector را تخمین برنید ( برای انجام واکنش مولاریته insert را سه برابر vector در نظر بگیرید )
2- حجم واکنش را در نظر بگیرید ( بهتر است یک میکروگرم DNA را درواکنشی به حجم 20-30 میکرولیتر انجام گیرد )
3- با آب دوبار تقطیر استریل حجم واکنش را تنظیم کنید
4- واکنش را مدت 5 دقیقه در 45 درجه قرار دهیدتا انتهاهای Cohesive کاملا" Relax شوند
5- بافر Ligation را با غلظت نهایی 1x استفاده کنید
6- یک میکرولیتر آنزیم T4 DNA ligase به واکنش اضافه کنید
7- چند ثانیه آن را spin کنید
8- مدت 3-2 ساعت در دمای 37 درجه قرار دهیدو سپس واکنش را ترانسفرم کنید.
18- پیدا کردن کلنی های حاوی Recombinant DNA:
در این کارگاه آموزشی از دو روش استفاده میکنیم
الف ) غیر فعال کردن ژن مقاومت به تتراسیکلین پلاسمید pBR322جایگاه آنزیم BamHI روی سکانس ژن مقاومت به تتراسیکلین پلاسمید pBR322 قرار دارد چنانچه DNA خارجی در جایگاه این آنزیم کلون شود و پلاسمید نو ترکیب در باکتری ترانسفرم گردد ، باکتری نسبت به تتراسیکلین حساس میشود.Insert DNA مورد استفاده که قطعه ای از DNA میتوکندری (kDNA) انگل لیشمانیا میباشد در حدود 800bp است که آن را در جایگاه BamHI پلاسمید pBR322 کلون میکنیم
1- محصول Ligation را درباکتری HB101 ترانسفرم کنید ( باکتری XL1-blue نسبت به تتراسیکلین مقاوم است و برای این آزمایش قابل استفاده نمیباشد).
2- محصول ترانسفرم شده را روی پلیت آگار حاوی آمپی سیلین و بدون تتراسیکلین پخش کنید.
3- روز بعد یک Master plate حاوی آمپی سیلین و بدون تتراسیکلین تهیه کنید و آن را شطرنجی نموده و خانه های آن را شماره گذاری نمایید سپس کلنی های حاصل از ترانسفرماسیون شب قبل را داخل خانه های شطرنجی (شماره دار) پلیت منتقل کنید.
4- روز بعدنیز آگار پلیت مشابه روز قبل تهیه کنید که دارای دو آنتی بیوتیک آمپلی سیلین و تتراسیکلین باشد (100μg /ml آمپی سیلین و 12.5μg/ml تتراسیکلین ) و هر کلنی را در خانه هم شماره آن روی پلیت حاوی تتراسیکلین و آمپی سیلین کشت دهید
5- روز بعد هر کدام از کلنی ها که رشد نکرد ه باشند حاکی از حساس بود ن آنها به تتراسیکلین میباشد (قطعه DNA مورد نظردر پلاسمید کلون شده است).
6- کلنی باکتری که رشد نکرده را از روی Master plate شماره 1 ( بدون تتراسیکلین ) پیدا کرده و از آن کشت شبانه تهیه کنید
پلاسمید آن را استخراج کرده و با آنزیم BamHI آن را برش دهید ، بعد از الکتروفورز باید قطعه DNA کلون شده را روی ژل مشاهده کنید ( تقریبا" 800bp میباشد ) .
ب) غیر فعال کردن ژن LacZ` پلاسمید Bluescript و مشاهده کلنی ها ی آبی و سفید
( alfa- complementation test ) همانطور که قبلا" گفته شد MCS پلاسمید Bluescript داخل ژن LacZ` تعبیه شده است . سکانس این ژن قسمتی ازسکانس ژن آنزیم β-galactosidase است , این آنزیم اثصالات بتا گالاکتوزیدی لاکتوز را تجزیه کرده و لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تبدیل میکند , همچنین ماده X-gal را که آنالوگ لاکتوز میباشد تجزیه کرده و رنگ آبی تولید میکند. سلولی (باکتری) که آنزیم بتا گالاکتوزیداز آن ناقص باشد یعنی ژن قطعه LacZ` را نداشته باشد چنانچه با پلاسمیدی که سکانس ژن LacZ` داشته باشد ترانسفرم گردد آنزیم بتا گالاکتوزیداز آن کامل میشود و میتواند لاکتوز یا X-galرا تجزیه کند. چنانچهinsert DNA درMCS این پلاسمید کلون شود ژن مذکور غیر فعال شده و باکتری نمیتواند بعد ترانسفرم شدن با پلاسمید X-gal را تجزیه کند در نتیجه رنگ آبی تولید نمیشود و کلنی های بیرنگ تولید میشود
A) در سیستم alfa-complementation test. کروموزوم باکتری ژن lacZ ناقص دارد و قسمت N ترمینال(alfa peptide) ژنβ-galactosidase راکد نمیکند و محصول ژن فاقداین قسمت میباشد . ژن lacZ` پلاسمید در داخل باکتری قسمت alfa peptide را کد میکند و ژن بتا گالاکنوزیداز فانکشنال تولید میشود که در حضور X- gal رنگ کلنی های باکتری آبی میشود . (b یک قطعه DNA در پلاسمید کلون شده ,ژن lacZ` ناقص شده است ونمیتواندX-gal راتجزیه کند در نتیجه کلنی های باکتری سفید میگردند.
1- DNA را در جایگاه آنزیم BamHI یا EcoRI پلاسمید Bluescipt کلون ( Ligate ) کنید.
2- واکنش Ligation را داخل باکتری XL1- blue ترانسفرم کنید ( ژنآنزیم β-galactosidase این باکتری ناقص است و همراه ژن LacZ` پلاسمید Bluescript کامل میشود اما ژن آنزیم بتا گالاکتوزیداز باکتری HB101 کامل است وبرای این منظور قابل استفاده نمیباشد )
3- باکتری ترانسفرم شده را روی آگار پلیت حاوی X-gal و IPTG پخش کنید ( IPTG یک ماده القاء کننده پروموتور ژن است و موجب بیان آنزیم β-galactosidase میشود ) .
4- قبل از پخش کردن واکنش روی پلیت , به هرکدام مقدار 40 میکرولیتر از 20 mM X- gal و 4 میکرولیتر از 200 mg/ml IPTG اضافه کنید.
5- روز بعد ( 16-12 ساعت ) کلنی های آبی و سفید روی پلیت آگاررشد میکنند که کلنی های سفید حاوی Recombinsnt plasmid میباشند
توجه : اگر پلیت حاوی X- gal و IPTG را چند ساعت در 4 درجه قرار دهید رنگ آبی بخوبی ظاهر میشود. مرکز کلنی حاوی ژن بتا گالاکتوزیداز آبی کم رنگ و محیط آن آبی پررنگ است. در مرکز کلنی های سفید نقطه آبی خیلی کم رنگ دیده میشود ولی محیط آنها بیرنگ است.کلنی های سفید راکشت دهید و پلاسمید آنهارااستخراج کنید. پلاسمید را با آنزیم BamHI هضم کنید باید بعد از الکتروفورز قطعه DNA کلون شده را روی ژل مشاهده کنید
19- Polymerase Chain Reaction ( PCR)
واکنش زنجیره ای پلیمراز روشی است که قسمتی از سکانس مولکول DNA که بین دو پرایمر قرار دارد توسط آنزیم پلیمراز وبکمک چهار داکسی نوکلئوتید تری فسفات در آزمایشگاه تکثیر (Amplify) میشود. .dsDNA متشکل از دو رشته آنتی پارالل میباشد که توسط اتصالات هیدروژنی وبصورت کووالانت به یکدیگر متصل هستند. همانند سازی DNA بکمک الیگو نوکلئو تید هایی که پرایمر گفته میشوند انجام میگیرد. الیگونوکلئوتیدها مولکولهای DNA تک رشته کوتاه هستند که هر کدام از آنها مکمل یک انتهای سکانس DNA هد ف ( الگو ) می باشند.پرایمر ها توسط آنزیم DNA پلیمراز و در حضور dNTPها از روی DNA الگو ( تک رشته ای است ) همانند سازی میکنند و رشته های جدیدی مکمل رشته های هدف سنتز میگردد.
مراحل یک سیکل PCR :1- مرحله Denaturation : در این مرحله DNA هدف بر اثر حرارت تک رشته ای میشود.
2- مرحله Annealing : در این مرحله با کاهش حرارت سیستم ، پرایمر ها در محل مناسب روی رشته مکمل متصل میشوند
3- مرحله Extension : در این مرحله که دمای آن برای آنزیم DNA پلیمرازمطلوب میباشد موجب توسعه پرایمر ها شده و همانند سازی DNA هدف انجام میگیرد. محصول PCR عبارت است از قطعه همانند سازی شده ای که دو طرف این قطعه سکانس پرایمر ها وجود دارند .
فاکتور هایی که روی کار آیی PCR تاثیر دارند:
1- بعد از 25تا 30 سیکل بعلت حرارت آنزیم دناتوره شده و غیر فعال میشود
2- غلظت زیادرشته های هدف موجب Reannealingآنها شده و با پرایمر ها رقابت میکنند .
روش PCR توسط مولیس کارمند شرکت Cetus ابداع گردید. ابتدا این کار توسط سه بن ماری با حرارت های مختلف انجام میگرفت واز آنریم کلنو بعنوان DNA polymerase استفاده میشد. این آنزیم در اثرحرارت دناتوره میشودو اجبارا"باید دوباره در هر سیکل به واکنش اضافه شود. Saiki از آنزیم DNA polymerase مقاوم به حرارت که از باکتری ترموس آکواتیکوس خالص میشود و اصطلاحا" Taq DNA polymerase گفته میشود استفاده کرد وامروزه واکنشPCR بصورت اتوماتیک انجام میگیرد.

پارامتر های موثر در PCR :

1- زمان و دمای Denaturation بستگی به تعداد G و C دارد
2- دمای Annealing پرایمرها که باید 3-4 درجه کمتر از دمای ذوب پرایمر ها باشد
3- زمانPrimer extension که به تعداد بازهای بین دوپرایمر بستگی دارد
4- - تعداد سیکلها
5- Ramp ( زمانی که طول میکشد تا دمای مبدا دستگاه به دمای مقصد برسد ) هرچه این زمان کمتر باشد نتیچه کار بهتر است و واکنش زمان کمتری در دمای ناخواسته قرار میگیرد
6- غلظت dNTP ها و یون منیزیوم ( اینها مجموعه ای را تشکیل میدهند که موجب فعالیت آنزیم پلیمراز میشوند و غلظت این دو ماده تابعی از یکدیگر میباشند )
7- غلظت Template DNA ( یک دهم تا یک میکروگرم میباشد ) چنانچه DNA هدف بصورت مالتی کپی در ژنوم باشد بهتر است.
8- اضافه کردن تشدید کننده های PCR
10- حذف مها رکننده های آنزیم از محیط
11- بهتر نقطه ذوب پرایمر ها (شبیه هم باشد ( Tm یکسان داشته باشند).
20- طراحی پرایمر :
پرایمر ها ی PCR بصورت کاملا" اختصاصی ومکمل ناحیه مورد نظر DNA هدف طراحی میگردند. پرایمر ها 30-20 بازدارند و پرایمر های بیش از 30 باز اختصاصیت خوبی ندارند. همچنین پرایمر باید دمای آنیلینگ بالا داشته باشد. بهتر است تعداد بازهای دوپرایمر مساوی باشند و از پلی پورین یا پلی پیریمیدین نباشند، همچنین نواحی تکرار شونده نداشته با شند چنانچه بازهای G یا C بصورت تکراری و پشت سرهم باشند پرایمر بصورت لوپ در می آید و عملا" سیستم کار نمیکند. انتهای 3` دو پرایمر نباید مکمل باشد زیرا پرایمر دایمر تشکیل میشود.نرم افزارهایی وجود دارد که طراحی پرایمر را انجام میدهند. بعد از طراحی پرایمر بهتر است تو سط نرم افزارهایی مانند Blast آنها را چک نمود تا مشخص شود که با چه ژنهای دیکر میتوانندAnneal گردند.در هر سیکل PCR تعداد مولکولهای DNA دو برابر میشود. رشته های DNA توسط حرارت (95-93درجه ) از یکدیگر باز میشوند ( Denaturing ) و سپس دردوره بعدکه حرارت پایین می آید (60-50درجه ) پرایمر ها بصورت اختصاصی به ناحیه هدف متصل میشوند ( Annealing ). آنزیم Taq DNA polymerase در دمای مطلوب (72درجه ) ودر بافر مخصوص , چهار( dATP, dTTP, dCTP, dGTP ) dNTP را طبق رشته الگو بهم متصل میکند (Extension ) .لازم به ذکر است که DNA های کوتاه ( Short target product ) یعنی رشته هایی که بین دوپرایمر محصور هستند بصورت تصاعد هندسی (exponential ) و DNA های بلند ( long target product ) یعنی رشته هایی که از یک طرف توسط یک پرایمر محدود هستند و از سمت دیگر نامحدود میباشند بصورت تصاعد حسابی (linearly ) زیاد میشوند .
مواقعی که پرایمر ها کاملا" مکمل DNA هدف( الگو) نباشند :
1- پرایمر هایی که برای ایجاد موتاسیون در یک ژن طراحی میگردند
2- پرایمرهایی که سمت 5` آنها جایگاه شناسایی آنزیم محدودگر تعبیه میشود تا بتوان محصول PCR را توسط آن آنزیم برش داد . این کار برای کلون کردن محصول PCR انجام میشود.
3- پرایمر هایی که لازم است محصول PCR آنها دارای پروموتور باشد و برای بیان یک ژن کاربرد دارند
فاصله دو پرایمر باید کمتر از 10 kb باشد ( کارآیی همانند سازی برای محصول PCR بیش از 3kb کمتر است ) بهتر است پرایمر ها را بر حسب کاری که لازم داریم طراحی شوند
چگونگی رد یابی ( detect ) محصول PCR :
1- هیبرید شدن محصول PCR با الیگو نوکلئوتید نشاندار ( پروب )
3- الکتروفورز روی ژل آگارز یا پلی اکریلامید
انواع PCR ( بمنظور تصحیح محصول ):
1- Hot start PCR : عبارت است از جدا کردن یک یا چند ترکیب مهم PCR ( ترجیحا" انزیم پلیمراز) بطوریکه بلا فاصله بعد ار دناتوراسیون DNA هدف به واکنش اضافه میشوند ( استفاده از , PCR gem و آنتی بادی آنزیم پلیمراز )
- Hot start بکمک آنتی بادی : مونوکلونال آنتی بادی ضد آنزیم پلیمراز را به واکنش اضافه میکننددرنتیجه فعالیت پلیمرازی آنزیم را مهار میکند. هنگامیکه دمای واکنش به 94 درجه میرسد آتی بادی دناتوره میشود و دو باره پلیمراز فعال میشود.
- Hot start بکمک Ampliwax : به دیواره لوله های محصوص اینکاربه نوعی واکس آغشته است که بعد از مختصری گرم کردن ذوب شده و روی ئاکنش را میپوشاند . آنزیم پلیمراز را روی واکس قرار میدهند . در دمای 94 درجه این واکس بخار میشود و آنزیم پلیمراز با واکنش تماس پیدا میکند
2- Touch down PCR : در این روش دمای آنیلینگ ازدمای بالاتر از Tm بندرت کاهش میابد وموجب کاهش محصول کاذب و پرایمر دایمر میشود.
3- Nested PCR : مواقعی که DNA هدف در نمونه مورد آزمایش کم باشد برای جلوگیری از بالابردن مقدار DNA و مهار واکنش توسط پرایمر های خارجی قطعه طویلتری همانند سازی میشود و از محصول PCR اول که بیشتر DNA هدف همانند سازی شده است یک واکنش دیگر با پرایمر های داخلی انجام میگیرد. در این روش اختصاصیت و حساسیت PCR بالا میرود.
5- Long distance PCR : با این روش قطعات ببیش از 20 kb همانند سازی میشوند. برای انجام این نوع PCR باید DNA ژنومی از کیفیت بالایی برخوردار باشدو پرایمر ها به دقت طراحی شوند. برای اینکاراز klon taq استفاده میشود.این آنزیم نسخه ای از DNA poly است که قسمت N ترمینال آن حذف شده است و با pfu poly به نسبت 180 به 1 مخلوط میشود و فاقد 5` اگزو نوکلئازی است

کلونینگ با PCR :

1- قرار دادن جایگاه شناسایی آنزیمهای برش دهنده در طرف 5` سکانس پرایمر.
مشکلات : این جایگاه ممکن است روی قطعه همانند سازی شده نیز وجود داشته باشد.
گاهی این جایگاه هنگام هضم شدن با آنزیم اشکال ایجاد میکندکه باید تعدادی باز به انتهای 5` پراپمر اضافه شود.
استفاده از جایگاه دو آنریم متفاوت در هضم اشکال ایجاد میکند.
2- Blunt end ligation : برای اینکار دو انتهای قطعه همانند سازی شده باید Polish شود این کار توسط آنزیمهای کلنو و T4 DNA polymerase ( پرکردن قسمت over hang ) و یا آنزیم های S1 nuclease و Mong bean nuclease انجام میشود
3- - T vector پلاسمید ناقل را با آنزیم EcoRV ویا هر آنزیم دیگرکه DNA را بصورت Blunt برش میدهد هضم میکنند سپس توسط آنزیم Terminal transferase یا آنزیم Taq poly تعدادی T به انتهاهای 3` رشته های پلاسمید خطی شده اضافه میکنند .( لازم به ذکراست که آنزیم Taq poly دارای خاصیت ترمینال ترانسفرازی است و تعدادی A به انتهای 3` محصول آمپلی فای شده اضافه میکند ) . با انجام واکنش Ligation پلاسمید و محصول PCR را بهم متصل میکنند.
4- تولید نیمه جایگاه شناسایی یک آنزیم برش دهنده در طرف 5` پرایمر. قطعات با T4 poly nucleotidkinase و ATP فسفریله میشوند و سپس بهم متصل میگردند ، بعد توسط یک آنزیم هضم شده و کلونینگ انجام میگیرد .

ایجاد تغییر در محصول PCR :
میتوان درسمت پایه5`` پرایمر یک پروموتور ویا جایگاه اتصال ریبوروم ( Ribosom Binding Site ) تعبیه نمود، همچنین میتوان یک Non tanslated leader بین پروموتور و ژن قرار داد تا ناحیه برای شروع سنتز پروتئین مناسب باشد. این کاربرد بنام Expression PCR گفته میشود
20- Reverse Transcriptase PCR ( RT- PCR ):
تعدادی از آنزیم های پلیمراز بجای DNA از RNA بعنوان سوبسترا استفاده میکنند واز روی RNA یک رشته DNA سنتز میکنند. رشته جدید سنتز شده را cDNA میگویند و واکنش بنام نسخه برداری معکوس Reverse transcription)) گفته میشود. آنزیمهایی که ار RNA بعنوان سوبسترا استفاده میکنند Reverse trnscriptase معروف هستند. آنزیم Tth که از باکتری ترموس ترموفیلوس بدست می آید در حضور یون منگنز فعالیت Reverse trnscriptase و در حضور یون منیزیوم فعالیت DNA polymerase دارد. آنزیم AMV که از یک نوع ویروس پرندگان بنام Avian Myeloblastosis Virus trnscriptase استخراج میگردد فعالیت RNase H هم دارد. دمای مطلوب فعالیت آن 42 درجه است و برای تهیه cDNA با طول کمتر از 500 b استفاده میگردد. آنزیم MMLV ازیک نوع ویروس جوندگان بنام Mouse Molony Leukemia Virus استخراج میشود و فعالیت RNase H آن کمتر از آنزیم قبلی میباشد . در 37 درجه فعالیت میکند . آنزیم Superscript آنزیم MMLV مهندسی شده است که ژن قسمتی که فعالیت RNAse H دارد را از آن حذف کرده اند و برای تهیه cDNA بزرگ استفاده میگردد.
PCR با پرایمر های احتمالی (Degeneracy primer):
این پرایمر ها بر اساس اطلاعات ترادف پروتئین یک ژن طراحی میشوند و بر اساس اسید های آمینه ای انجام میگیرد که دارای یک یا دو کدون باشند.پرایمر هایRAPD - بنام پرایمر های اختیاری هم گفته میشوند . این پرایمر ها پلی مرفیسم را بدون شناخت توالی نوکلئوتیدی ردیابی میکنند
21– استخراج DNA از خون :
1- مقدار 500 میکرولیتر خون ( خون لخته نشده باشد – برای کارهای PCR از EDTA بعنوان ضد انعقاد استفاده شود زیرا مواد ضد انعقاد دیگر مهار کننده آنزیم پلیمراز میباشند)
2- مقدار یک سی سی از باهر لیز کننده به آن اضافه کرده سانتریفیوژ نمایید
Lysis buffer = 0.33 M sucrose, 10mM Tris , 5mM MgCl2, 1% Triton X-100
3- مایع رویی را دور بریزید و رسوب خاصل را چندین مرتبه در بافر فوق سوسپانسسیون نموده سانتریفیوژ کنید تا رسوب بدست آمده شفبف گردد.
4- مقدار 400 میکرولیتر بافر لیز کننده به آن اضافه نموده سوسپانسیون کنید و مدت 20 دقیقه بجوشانید.
5- با فنل و کلرفرم آن را استخراج کنید
6- با الکل آنرا روب داده و در 50 میکرولیتر آب حل کنید
7- مقدار 2-5 میکرولیتر آن را برای واکنش PCR استفاده کنید.
22- انچام واکنش PCR
توجه : آزمایش باید در محلی بدون رفت و آمد انجام گیرد . سمپلر های مورد استفاده نباید برای کارهای دیگر استفاده شوند ، ظروف، لوله ها و سر سمپلر ها اتو کلاو شوند و هنگام کار از دستکش استفاده شود .
انجام واکنش PCR : مواد زیر را داخل لوله مخصوص واکنش PCR بریزید :
10mMdNTP 0.5 μl (0.1mM)
10x PCR buffer 5 μl
MgCl2 1.5 μl (1.5 mM)
Primer -1 20pmmol
Primer -2 20 pmol
Taq DNA polymerase 0.25 μl ( 1.25 U)
Template DNA 0.1- 1 μg
dH2O up to 50μl
لوله ها را داخل Block دستگاه ترموسایکلر قرار دهیدو دستگاه را روشن کنید. (مقدار 100 μl روغن معدنی روی واکنش بریزید تا از بخار شدن مواد ممانعت بعمل آورد. لازم به ذکر است که دستگاههای ترموسایکلرجدید بصورت Heated lid ساخته شده اند یعنی درب دستگاه که روی لوله های واکنش قرار میگیرد حدود 105 درجه گرم میشود در نتیجه بالای لوله گرمتر از پایین آن است و از بخار شدن مواد داخل لوله جلوگیری میشود). پس از اتمام کار محصول آمپلی فای شده را با آگارز 3 درصد الکتروفورز کنید.
.23 - استخراج RNA از سرم:
از دستکش یکبار مصرف استفاده کنید. تیپ و لوله های مورد استفاده را اتوکلاو شوند. در محیط کار و دستها RNase زیاد است و RNA زود هیدرولیز میشود لوله , تیپ و مواد و لوازمی که با RNA در تماس هستند نباید با دست بدون دستکش تماس پیدا کنند.
1-مقدار 500 میکرولیتر از بافر RNXplus در لوله 5/1 سی سی بریزید
2- مقدار 100 میکرولیتر از سرم به آن اضافه کنید و درب لوله رابسته خوب محلوط کنید
3- مقدار 100 میکرولیتر کلرفرم به آن اضافه کنید
4- درب لوله رابسته و خوب بهم بزنید و 2 دقیقه در هوای آزلد قرار دهید
5- مدت 10 دقیقه با 10هزار دور در دقیقه سانتریفیوژ کنید
6- مایع شفاف رویی را به لوله جدید منتقل کنید.
7- دوبرابر حجم آن الکل مطلق اضافه کرده و 10 دقیقه سانتریفیوژ کرده مایع رویی را حذف کنیدو لوله را وارونه روی کاغذ جاذب الرطوبه قرار دهید
8- مقدار 100 میکرولیتر الکل 75 درجه اضافه کرده سانتریفیوژ کنید و سپس مایع رویی را خذف کرده و رسوب را خشک کنید
9- رسوب را در 40 میکرولیتر DEPC treated water حل کنید
24- انجام RT-PCR:
1- مقدار 10 میکرولیتر از RNA مرحله قبل را RT-PCR استفاده کنید
RNA 10 μl
RT buffer 4 μl
RT enzyme 0.5 μl
RNasine 0.3 μl
dNTP 1 μl
primer (1&2) 20pmol
DEPC water up to 20 μl
قبل از اضافه کردن RNA مدت 10 دقیقه آن را در 70 درجه قرار دهید تا از تشکیل لوپ جلوگیری شود. واکنش را یک ساعت در 42 رجه قرار دهید و سپس 5 دقیقه در 94 قرار دهید تاRT غیر فعال شود وآنزیم پلیمراز را مهار نکند. سپس به هر لوله مقدار 0.25 μl آنزیم پلیمراز اضافه کنید و با برنامه زیر واکنش را 30 سیکل ادامه دهید:
Denaturation 94o 30 sec
Annealing 55o 30 sec
Extension 72o 30 sec
برای واکنش Nested مقدار یک میکرولیتر از محصول PCR استفاده کنید
Taq poly 0.25 μl
10 x PCR buffer 5 μl
Mg Cl2 1.5 μl
Primer (F&R) 3 μl
DNA 1 μl
dH2O up to 50 μl
واکنش را مختصری سانتریفیوژ کنید وبا برنامه زیر واکنش را 30 سیکل ادامه دهید:
Denaturation 94o 30 sec
Annealing 57o 30 sec
Extension 72o 30 sec
در انتها مدت 5 دقیقه آن را دردمای 72 درجه قرار دهید واکنش را با ژل آگارز 3 درصد الکتروفورز کنید ( پرایمرها تعداد 250bp را از ناحیه 5`UTR ویروس هپاتیت C را آمپلی فای میکنند.

باید ها و نباید ها در PCR

1. هنگام تهیه واکنش نمونه کنترل مثبت را آخر کار تهیه کنید
2. اعمال قبل و بعد از PCR جدا از همدیگر انجام گیرند
3. برای استفاده ازهر ماده از پیپت جدا گانه و اختصاصی استفاده کنید
4. از پیپت هایی که دارای plug هستند و یا از پیپت های یکبار مصرف استفاده کنید
5. مواد ذخیره آزمایشگاه را تقسیم کرده و فریز کنید و هرچند وقت صحت آنها راکنترل کنید
6. هنگام استفاده هرلوله را spin کنید تا موادی که به اطراف درب لوله چسبیده اند رسوب کنند
7. چند ین کنترل منفی حین آزمایش Run کنید
8. برای انحام آزمایشهای تاییدی ازموادفریز شده استفاده کنید
9. هیشه DNA آمپلی فای شده را خارج از محل آماده کردن نمونه نگهداری کنید
10. هنگام کار با PCR product مقداری از آن را جدا گانه نگهدارید
25- آنزیمها ی مورد استفاده درمهندسی ژنتیک
آنزیم هاابزار کار مهندسی ژنتیک در آزمایشگاه میباشند و مخقق بدون آنها نمیتواند کاری انجام دهد. در این درس با انواع آنزیمها و طرز کار آنها آشناشده و مورد استفاده هر کدام را بررسی میکنیم.
الف ) لیگازها :این آنزیمها اتصال فسفو دی استر بین تک رشته ها را روی رشته DNA تک رشته ای بر قرار میکند. 5`-p یک رشته به 3`-OH رشته دیگر متصل میشود.. کو فاکتور آنها ATP یا NAD است .
1- آنزیم DNA ligase : این آنزیم از باکتری E.coli استخراج می شود وکوفاکتور آن NAD است و اکثرا" اتصال بین دو DNA که برش انتهایی ا نها بصورت Cohesive باشد را بر قرار میکند و عده ای معتقدند که این آنزیم در فر قرار کردن اتصال بین دو DNA که برش انتهایی آنها بصورت blunt باشد مشکل خواهد داشت .
2- آنزیم T4 DNA ligase : این آنزیم از فاژ T4 استخراج میشود وکوفاکتور آن ATP است . این آنزیم اتصال هر دو انتهای Cohesive و blunt را بر قرارمیکند.
3- آنزیم T4 RNA ligase : این آنزیم اتصال فسفو دی استربین 3`- OH و 5`-P مولکولهای RNA را بر قرار میکند . کوفاکتور آن ATP و Mg2+ است
ب) نوکلئاز ها : این آنزیم ها نوکلئو تید هار ا تجزیه میکنند.
4- آنزیم DNase I : یک اندو نوکلئاز است و dsDNA را به روش غیر اختصاصی تجزیه میکند . کوفاکتور آن Mg2+ ، + Ca2 و Mn2+ است .. این آنزیم برای مقا صد زیر استفاده میشود:
- تجزیه غیر اختصاصی DNA
- نشاندار کردن DNA
- ایجاد موتاسیون در ژن
5- نوکلئاز استافیلوکوکی : DNA و RNA را به روش غیر اختصاصی تجزیه میکند.
6- انزیم RNase A- این آنزیم RNA تک رشته ای را هیدرولیز میکند.
7- آنزیم RNase H - این آنزیم RNA را که با DNA دوبلکس شده باشد راهیدرولیزمیکند و در سنتز رشته دوم cDNA کاربرد دارد.
8- آنزیم S1 Nuclease : این آنزیم پلی نوکلئو تید تک رشته ای را هیدرولیز میکند.
9- آنزیم Mong bean Nuclease – این آنزیم شبیه S1 Nuclease عمل میکند
10- آنزیم Exonuclease III (گزو نوکلئاز : (3`→ 5 فعالیت 3` فسفاتاز دارد
همچنین فعالیت شبیه RNase H هم دارددارد.
این آنزیم اتصال فسفودی استرجایگاههای آپورینی یا آپیریمیدینی را تجزیه میکند
11- آنزیم Bal1 Nuclease : این آنزیم ssDNA را به روش اگزو نوکلئازی یا اندو نوکلئازی تجزیه میکند
ج ) آنزیم های محدود گر
د) متیلازها 12- فسفاتازها : این آنزیمها فسفومونواسترازغیراختصاصی هستندکه درpH قلیایی فعالیت میکنند و درحضور پذیرنده های فسفات مانند اتانل آمین و Tris بعنوان فسفو ترانسفراز عمل میکتتد .
فسفاتاز اتصال P--O را تجزیه میکند ولی فسفوریلاز اتصال C--O را تجزیه میکند
کاربرد فسفاتاز ها :
دفسفریلاسیون انتهای فسفات اسید نوکلئیک
وقتی با پروتئین یا اسید نوکلئیک کنژوگه شوند بعنوان آنزیم رپورتر عمل میکند
بعنوان leader در ترشح خارج سلولی و پروتئین های فیوژن عمل میکند
13- آنزیمهای T4 poly Nucleotid Kinase : این آنزیمها فسفات γ را از NTP به مولکول پذیرنده (Aceptor) انتقال میدهد و عبا رتند از:
پروتئین کیناز ها
کربو هیدرات کینازها
پلی نوکلئو تید کینازها
آنزیم T4 poly nuleotide kinase برای فسفریله کردن یا نشاندار کردن 5`- OH استفاده میشود ، همچنین برای اندازه گیری فعالیت اندونوکلئازی بکار میرود.
ه ) DNA پلیمرازها : گروهی از آنزیمها هستند هستند که بکمک چهار نوکلئوتید تری فسفات (dNTP) از روی رشته الگو یک رشته DNA سنتز میکنند. این آنزیمها برای فعالیت خود احتیاج به پرایمر دارند. چنانچه دارای فعالیت 3→ 5`` اگزونوکلئازی باشند کار غلط گیری ( proof reading ) را هم انجام میدهند
14- آنزیم DNA polymerase I :
این آنزیم دارای فعالیت های زیر است :
فعالیت 3→ 5`` اگرونوکلئازی
فعالیت 5`→ 3` DNA پلیمرازی
فعالیت RNase H
فعالیت نوکلئازی
این آنزیم برای کارهای زیر استفاده میشود :
DNA LabelingNick translation
ایجاد انتهاهای Blunt
15- آنزیم T4 DNA plymerase: یک آنزیم مولتی فانکشنال است وبرای کارهای زیراستفاده میشود.
دارای فعالیت DNA پلیمرازل
فعالیت 3→ 5`` اگرونوکلئازی
برای PCR هم قابل استفاده است و در 37 درجه فعالیت میکند
برای ایجاد انتهاهای Blunt در dsDNA استفاده میشود
فعالیت 5` نوکلئازی ندارد
16- آنزیم T7 DNA plymerase: این آنزیم دارای فعالیت 3→ 5`` اگرونوکلئازی میباشد
Sequenase نسخه ای از این آنزیم است که فاقد فعالیت 3→ 5`` اگرونوکلئازی میباشد وبرای Sequencing استفاده میشود
سرعت پلیمریزاسیون این آنزیم زیاد است و برای سنتز رشته موتاژن در موتاژنزیس بکار میرود
انتهای 5`overhang را پر میکند
17- آنزیم Taq DNA polymerase : این آنزیم از باکتری گرمادوست ترموس اکواتیکوس استخراج میشود
فعالیت 3→ 5 اگزو نوکلئازی ندارد
فعالیت 5` نوکلئازی دارد
فعالیت ترمینال ترانسفرازی دارد
آنزیمهای نسخه بردار معکوس () : گروهی از DNA polymerase ها بنام RNA - dependent DNA polymerase یا Reverse Transcriptase گفته میشوند این آنزیمها RNA را الگو قرار داده و DNA مکمل آن را سنتز میکند و عبارتند از:
18 - آنزیمAvian Myeloblastosis Virus ) AMV) : این آنزیم از نوعی ویروس استخراج میشود که در پرندگان بیماری ایجاد میکند .
این آنزیم فعالیت RNase H هم دارد و برای سنتز رشته دوم cDNA استفاده میشود
19- آنزیم Molony Murine Leukemia Virus ) MLMV) : این آنزیم از نوعی ویروس استخراج میشود که در جوندگان بیماری ایجاد میکند.
آین آنزیم فعالیت RNase H کمتری از آنزیم AMV دارد
20 – آنزیم ترمینال ترانسفراز :
این آنزیم پلیمریزاسیون dNTP هارا ازروی پایه 3`- OH انجام میدهد . این آنزیم برای اتصال نوکلئوتید ها به انتهای 3`- OH رشته DNA استفاده میشود وبرای کلونینگ محصول PCR قابل استفاده است.
21- آ نزیم های RNA polymerase :
این آنزیم ها اطلاعات ژنتیکی را از DNA به RNA منتقل میکنندو عبارتند از
RNA پلیمراز باکتریایی
T7 RNA پلیمراز ، یک پروموتور قوی دارد
T3 RNA پلیمراز
SP6 RNA پلیمراز
22- آنزیم پلیمراز A: :
این آنزیم دم پلی A را سنتز میکند ودر انتهای3` رشته mRNA سلولهای یوکاریوت غیر هیستونی یافت میشود.
این آنزیم میتواند RNA های polyA منفی را به polyA+ تبدیل کندو آنها را بکمک oligo) dT) بعنوان پرایمر، به cDNA تبدیل نماید
23- آنزیم های رپورتر / مارکر:
ابن آنزیمها در کلونینگ استفاده میشوند وچون سریعا" بیان میشوند برای غربالگری کلنی های باکتریایی مفید میباشند ( آنزیم بتا گالاکتوزید ازبرای غربالگری توضیح داده میشود)
ß گالاکتوزیداز - اتصالات گالاکتوزیدی را در الیگو ساکارید ها هیدرولیز میکند
ß لاکتاماز - اتصالات آمیدی را در حلقه ß لاکتام هیدرولیز میکند و پنی سیلینوئیک اسید و سفالوسپوروئیک اسید تولید میکنند که از نظر بیولوژیک غیر فعال هستند
-کلرامفنیکل استیل ترانسفراز ( CAT) - کلرامفیکل را غیر فعال میکنند
-لوسیفرازها - آنزیم های تولید کننده نور هستند.
آنزیم های ( برش دهنده) محدود گر ((Restriction Enzymes
اندو نوکلئازهای محدود کننده گروهی از DNase ها میباشند که توالی نوکلئو تیدی خاصی را شناسایی میکنند . این آنزیم ها dsDNA را بصورت اختصاصی یا غیر اختصاصی برش میدهند. این آنزیم ها اولین بار در دهه 1950 به عنوان سیستم های Resriction وModification ( باکتریها برای جلوگیری از حمله باکتریوفاژها و عناصر ژنتیک خارجی این سیستم ها را بکار می برند ) کشف شدند. باکتریها توسط سیستم R-M میتوانند DNA ای را که از خارج هنگام عفونت ،کنژو گاسیون و ترانسفکشن وارد آنها میشود را تخریب کنند.سیستم R - M باکتریایی معادل سیستم ایمنی پروکاریوتی میباشد.سیستم های R-M که در میکرو ارگانیسمها ( باکتریها ) یافت میشوند بسیار گوناگون میباشند (حتی در داخل یک سلول ) . تعداد این آنزیمها از 2100 فراتر رفته و 17 آنزیم نوع I ، 179 آنزیم نوع II و 4 آنزیم از نوع III وهمچنین مشخصات 190 متیل ترانسفراز تغییر دهند DNA تعیین و شناسایی شده است .
سیستم هایR-M دو فعالیت آنزیمی دارند:
الف ) یک اندونوکلئاز (R.ENase) با جایگاه اختصاصی که مسئول هضم DNA خارجی میباشد
ب) یک متیلاز تغییر دهنده DNA ( متیل ترانسفراز ) که همان توالی ویژه را شناسایی میکند . متیل ترانسفراز ( M.MTase) مسئول تغییر دادن وحفظDNA خودی از هضم شدن توسط R.ENase میباشد. ممکن است فعالیت R وM در یک آنزیم (واحد) که دارای چند زیر واحد است قرار داشته و یا از نظر فیزیکی آنزیم های جداگانه باشند. علی رغم اینکه آنزیم های Restriction و Cognate Modifications سکانس مشابه را شناسایی میکنند، ترادف اسید آمینه آنها یکسان نیست، شاید این آنزیم ها با مکانیسم متفاوت DNA هدف را شناسایی میکنند .
انواع سیستم های آنزیمی Restriction - Modification
بر اساس ترکیب آنزیم ، کوفاکتورهای مورد نیاز ، قرینگی توالی DNA ای که شناسایی میکنند و مشخصات هضم DNA به چهار نوع تقسیم میشوند. لازم به ذکر است که گروه متیل دهنده سوبسترا در تمام متیل ترانسفرازها AdoMet میباشد.
آنزیم های R-M نوع I:
مجموعه چند آنزیمی متشکل از زیر واحد های غیر همسان بنام R,M و S میباشند. زیر واحد S اختصاصیت را برای MوR تعیین میکند. کوفاکتور های این آنزیمها ATP وMg2+ میباشند و DNA ای که تغییری در آن ایجاد نشده باشد را در محلی دور از جایگاه شناسایی و تا اندازه ای بصورت احتمالی ( Random ) برش میدهند . هیدرو لیز ATP قسمتی از فعالیت Restriction این آنزیم ها میباشد و بطریق رقابتی با فعالیت اندون.کلئازی خودش جایگاه اختصاصی DNA هدف را متیله میکنند.
آنزیم های R-m نوع II :
این آنزیمها دارای فعالیت R.ENase و M.MTase جداگانه میباشند . R.ENase ها دایمر بوده و زیر واحد های آنها همسان است در صورتیکه M.MTase ها آنزیم های مونومر میباشند . R.ENase های نوع II برای فعالیت خود فقط Mg2+ نیاز دارند.
R.ENase ها و M.MTase ها توالیهای اختصاصی نوکلئوتیدی مشابه را شناسایی میکنند . اکثر R.ENase های نوع دوم DNA را ازمحل جایگاه شناسایی برش میدهند ولی تعدادکمی از آنها که نوع IIS گفته میشوند DNA را در فاصله معینی از جایگاه شناسایی برش میدهند .
آنزیم های R-M نوع III:
این آنزیم ها متشکل از دو زیر واحد غیر همسان میباشند که برای فعالیت رستریکشن به ATPو Mg2+ نیاز دارند. این آنزیم هاتوالی های کوتاه غیر پالیندرم را شناسایی کرده و DNA را از محلهای معین (درصورتیکه درجایگاه شناسایی تغییری ایجادنشده باشد )برش میدهند این آنزیمها ATP را هیدرولیز نمیکنند و برای برش دادن DNA به AdoMet ( S-adenosylmethionine)نیاز ندارند اما AdoMet موجب تحریک فعالیت اندو نوکلئازی آنهامیشود.
آنزیم های نوع IV :
این آنزیمها از نظر تکاملی بین آنزیم های نوع IIوIII میباشند. این آنزیمها (مانند Eco571) متشکل از R.ENae و M.MTase جدا گانه میباشند اما R.ENase که یک آنزیم مونومر میباشد فعالیت متیلازهم دارد. این فعالیت متیلازی قدرت کافی ندارد تا DNA میزبان را در In vivo محافظت کند.R.ENase و M.MTase توالی های ناقرینه را شناسایی میکنند . R.ENase در حضور Mg2+ در فاصله معینی از جایگاه شناسایی, DNA هدف را برش میدهد ( مثلا" Eco571 بفاصله 14/16 نوکلئو تید از محل شناسایی این کار را انجام میدهد ) . فعالیت Restriction آنها توسط AdoMet تحریک میشود.
سیستم های Modification یا Restriction مستقل
علاوه بر چهار سیستم آنزیمی که بحث شد ، بعضی از باکتریها سیستم های دیگری مانند سیستم R مستقل از M و سیستم M مستقل از R دارند. یک مقوله ای از سیستم های R-M که در تکنولوژی نو ترکیب اهمیت بخصوصی دارد Restriction وابسته به Methylation ) MDRS) میباشد که R.ENase ترجیحا" DNA را در جایگاههای متیله برش میدهد . MDRS متشکل از فرآورده های ژنی است که به چندین جایگاه مستقل در ژنوم E.coli K12 مانند mcrA , mcrB و mrr متصل میباشند. جدول شماره 5- طبقه بندی سیستم های R-M

سیستم های R-M

Feature	نوع I	نوع II پروتو تایپ نوع IIS	نوع III	نوع IV
ساختمان فعال R-M	یک آنزیم با سه زیر واحد (R.M.S)	انزیم های جدا گانه Rدایمر Rمونومر Mمونومر M	یک آنزیم با دو زیر واحد	آنزیم عای مونومری جدا گانه
کوفاکتورها	ATPو mg 2+	mg 2+	ATPو mg 2+	(AdoMet) mg 2+
جایگاه شناسایی	غیر قرینه	پالیندرم غیر قرینهه	عیر قرینه	غیر قرینه
هضم DNA	فاصله متغیر از هر طرف	همان جایگاه به فاصله معینی از طره 3`	25-27bpاز طرف 3`	14bpاز طرف3`
متیلاسیون	دو رشته را بوسیله M متیله میکند	دو رشته یک متیل ترانسفراز روی هر رشته	فقط یک رشته	دو رشته